结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，病灶可在全身多个系统，其中最常见的是肺结核。
一、结核病疫情
呼吸道传播是结核菌传染的主要方式，其中80%发生在肺部，其他部位也可感染。
结核病是一个全球性的严重公共卫生问题，据世界卫生组织报告，2015 年，据估计全世界新发结核病数量约为 1040 万例，其中 590 万为男性（占56%），350 万为女性（占 34%），100 万为儿童（占 10%）。120 万新发结核病例为艾滋病毒感染者（占 11%）。据估计有 140 万人死于结核病，其中 40 万艾滋病毒感染者[1]。我国是全世界 22 个结核病流行严重的国家之一[2]。2015年WHO估算中国结核病的发病数为93万例，发病率68/10万；死亡约3.8万例，死亡率为2.8/10万。估算中国的耐多药结核病患者为5.2万例，结核菌与HIV双重感染患者约为1.3万例[1]。
结核菌和艾滋病病毒的双重感染值得关注，结核病是艾滋病病毒感染者和患者最常见的死亡原因[3]。现在，结核菌合并 HIV 双重感染已经成为结核病防治工作的一大难题[4]。两种病相互影响、相互促进发展，严重影响患者的生存质量[5]。
二、结核病实验室诊断方法
简便、快速、准确的诊断和及时有效的治疗对结核病的传染控制至关重要。实验室诊断在结核病诊断中起着决定性的作用，以下就结核病实验室诊断方法的研究进展作一综述。
1、细菌学检测
1.1抗酸杆菌涂片镜检法
抗酸染色镜检法是经典的MTB检测方法，也是最基本的细菌学检查方法。其优点是简单、快速、廉价、无需特殊设备，因而被广泛应用。缺点是灵敏度较低仅20％～30％，假阳性和假阴性较高，特异性差，无法区别死菌与活菌，并且受检验人员的技术水和收集痰液标本的质量影响很大。张立群等对比了４种不同结核分枝杆菌检测方法，显示抗酸染色涂片阳性率为11.6％ ，灵敏度仅为26.3％ ［6］ 。
1.2荧光染色法
荧光染色法以金胺O-罗丹明为代表，提高了镜检的灵敏度，使读片时间大大缩短，假阳性和假阴性也明显降低[7]。但荧光显微镜昂贵的价格，限制了其在基层的应用。
1.3发光二极管（LED）荧光显微镜检查
将显微镜与发光二极管相结合研发的LED 荧光显微镜，操作简单、价格低廉、寿命长，大大缩短了读片时间，同时具有较高的敏感性和特异性。多项研究显示：LED 检查的阳性率比传统镜检法高［8］，同时具备荧光染色的优点，且花费低、可实施性强，有望广泛地常规使用，尤其在基层肺结核患者的发现和治疗检测上有一定的应用价值。
1.4 培养法
分枝杆菌培养法是目前诊断结核病的金标准。罗氏培养法培养时间长，需要4～6周才能检测到生长，阳性率只有30～40％[9]。液体变色培养基测定法培养时间平均10天，操作简便，但是阳性率不高，结果判断易带主观性，变色存时间较短，仅2～3ｄ紫色即消失，需及时观察结果[10]。液体培养基快速培养比传统固态培养基更灵敏、更快速。本法适于在发展中国家和贫困地区推广应用[11]。
2、噬菌体生物扩增法
噬菌体生物扩增法是一种新型的结核诊断方法，其原理为: 分枝杆菌噬菌体可感染相应的活的分枝杆菌，若临床标本中含有相应的分枝杆菌，噬菌体可侵入菌体内进行大量繁殖，最终裂解菌体，在琼脂板上出现噬菌斑。因此，根据噬菌斑的有无可判断临床标本中是否存在相应活的分枝杆菌。检测方法优点为快速，2 天内出结果; 只检测活的结核菌；简单，不需培养，无需特殊仪器。该法还可应用于耐药性测试实验中，利福平耐药 PhaB 检测方法已非常成熟meta 分析显示其具有较高的诊断灵敏度( 81%～100%) 和特异性 (73%～100%)[12]。Rondón 等[13]最近研发表了能用于多重耐药检测的新型荧光噬菌体扩增技术，该技术使用了一种能编码增强型绿色荧光蛋白的新噬菌体，以荧光形式报告检测结果，具有良好的应用前景。
3、分子生物学检测技术
3.1聚合酶链反应（PCR）
PCR 又称DNA体外扩增技术，可将微量DNA扩增到100万倍，扩增物通过电泳或放射自显影等技术即可检出。与传统检查方法相比较，有快速、敏感性高（能检出１～２０个细菌的DNA） 、特异性强、标本无需培养等优点。对肺结核患者的痰、胸水、支气管肺泡灌洗液标本采用涂片、培养与PCR对比，PCR 的阳性率明显高于涂片和培养［14］。PCR 自20世纪80年代问世以来，被大量用于结核病实验室研究及临床诊断，但由于存在很多问题如易污染、假阳性高、使用致癌物（溴化乙锭）、操作繁琐等曾一度被质疑。
3.2基因芯片技术
基因芯片技术采用的检测方法是 DNA杂交技术和 PCR 不对称扩增技术相结合的分子诊断方法[15]。该法可以同时将大量探针固定于载体上，所以一次可以对大量样本进行检测和分析。该法虽然简单快速，所需样本量少，检测过程耗时端，但是芯片的制备较复杂，样本准备和标记又较为繁琐，检测成本高，需昂贵的特殊设备，因此该法难以在临床常规开展。
3.3荧光定量PCR（FQ‐PCR）
FQ‐PCR是近年发展起来的核酸定量技术，是在经典PCR的基础上，巧妙地把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的定量检测。该项技术的特点是在封闭状态下检测，避免了扩增产物污染所致的假阳性；光谱技术提高了灵敏度；荧光探针杂交进一步提高了特异性［16］，[17]。
4、影像学检查
4.1计算机断层扫描（CT）
计算机断层扫描可对肺结核病灶活动性进行判断，动态观察病灶的变化，可作为合理采取治疗措施的参考；对肺结核耐药菌有一定帮助，经抗结核治疗影像表现加重及合并外-282-结核时应考虑到结核耐药[18]。
4.2磁共振成像（MRI）
结核性脑膜炎的早期诊断非常困难，早期的临床表现、脑脊液检查常无特异性，MRI可清楚显示结核性脑膜炎的各种病理改变，尤其是MRI增强扫描[19]。何四平[20]等认为早期结核性脑膜炎的MRI增强扫描可表现为正常或脑膜弥漫性线状强化，有助于诊断活动性结核。
5、免疫学检测技术
从免疫学的观点看，结核病是一种和免疫反应有密切相关的免疫紊乱性疾病[21]。
5.1血清抗结核抗体检测
应用MTB蛋白抗原检测患者血清中特异性抗体是结核病常用的辅助诊断方法之一，上个世纪７０ 年代酶联免疫吸附试验（ELISA）开始用于检测患者血清中结核特异性抗体，近年来临床上已很少使用，只用于一些特殊检测目的。近十几年来，胶体金和膜反应技术的发展，使得金标免疫斑点法因其无需特殊仪器而成为检测结核抗体的快速诊断技术。由于MTB 表面抗原的多位点表达、结核患者免疫功能不同导致对抗原识别的差异以及同一患者在疾病的不同阶段对不同的抗原产生不同水平的抗体，使得每个患者的血清识别抗原的种类、数目和水平都有显著性差异，因此，任何一种单一抗原都无法检测到结核病患者体内所有的抗体，在保证特异性的同时，多种抗原联合提高检测的敏感性已成为检测结核抗体的趋势。目前，商品化的检测试剂盒有38kD、16kD、LAM 蛋白芯片，以及结明三项试验TB‐CHECK、TB‐DOT、TB‐IgG，临床应用结果显示与诊断的“金标准”有较好的一致性，菌阳和菌阴肺结核患者血清MTB抗体检测阳性率均较高［22］，[23]。如何选择候选抗原，了解它们之间的互补性，从而制备出灵敏度高、特异性强的蛋白芯片用于结核抗体的检测将是今后血清学诊断的研究方向。
5.2结核菌素皮肤试验
结核菌素皮肤试验又称PPD试验，是通过测量经皮内注射结核菌素后在注射部位产生的硬结（肿块、鼓包或水泡）大小来诊断是结核感染的古老方法，这一方法自上世纪初诞生后至今仍广泛使用。
早期的结核菌素试验使用旧结核菌素，是将结核杆菌培养物热灭活后粗提制备的。为了提高反应的特异性，将结核杆菌培养物热灭活后经过过滤、沉淀和除菌后精制而成现在的使用的纯蛋白衍生物，即PPD。我国使用的PPD是从卡介菌中制备的BCG-PPD,它仍然是由大约200多种蛋白质组成的复杂混合物，它们中的大多数蛋白质与卡介苗和环境中的非结核分枝杆菌有共同的识别位点（表位），因而，卡介苗接种和非结核分枝杆菌感染对PPD试验的结果干扰很大。
由于PPD试验是体内迟发型超敏反应，硬结的形成受个体免疫状态的影响较大。个体的营养状况、免疫功能、合并的病毒感染或免疫抑制性疾病、使用皮质类激素药物以及恶性肿瘤等都会影响硬结的形成，这会导致PPD试验在已经诊断为肺结核的病人中出现10-25%的假阴性[24]。在结核性脑膜炎或感染结核的艾滋病患者中，假阴性比例甚至高达50%以上[24]。在这种情况下，PPD试验阴性时并不能排除活动性肺结核。
另外，由于PPD试验的结果一般需要在48-72小时后由有经验的医生判定，因而需要检查者再次到门诊或医生的随访，这无疑增加了获得结果的难度和成本，会造成一定比例结果的丢失，在一定程度上又增加了疾病防控的难度。
5.3干扰素γ释放分析试验（IGRA）
近年来日趋成熟的干扰素γ（IFN-γ）释放分析（IGRA）技术，是一种新的体外免疫诊断方法，由于其良好的敏感度和特异性，这一技术正在结核相关疾病的诊断中显示出其特有的优势，已成为国际上该领域关注的热点，有可能在结核防控领域产生革命性的变革[25]。
IGRA与PPD试验相同的是，它是一种基于T细胞的免疫诊断技术，不同的是，IGRA技术是在体外用特异性抗原刺激待检样本释放IFN-γ，通过定量检测释放的IFN-γ的水平或计数可以有效释放IFN-γ的细胞来诊断结核杆菌感染的情况。
由于IGRA技术需要特异性抗原的体外刺激，因而刺激抗原及其作用方式的选择是影响IGRA特异性和敏感性的重要因素。在IGRA技术建立的早期，使用PPD作为刺激抗原，虽然敏感性高，但是特异性非常不理想。要进一步提高IGRA的敏感性和特异性，必须寻找更为特异的抗原刺激物。
结核分枝杆菌基因组共编码4000个基因。应用生物信息学和DNA微阵列技术，通过比较结核分枝杆菌和用于制造卡介苗的BCG菌株的基因组发现，有11个差异区（RD）在用于制造卡介苗的所有菌株中都不存在。这11个RD区分别为RD1、RD4-RD7、RD9-RD13和RD15[26]。后来在结核杆菌培养物滤过液中分离到一个6kD的早期分泌靶蛋白ESAT6和一个10kD的培养滤过蛋白CFP10，被证明是由RD1区编码的。这两个RD1区的蛋白仅存在于结核分枝杆菌复合物和五个环境中的非致病分枝杆菌中。已经在人和动物模型中证明，ESAT6和CFP10能被结核杆菌Th1 T细胞专一性识别，引起强烈的特异性的T细胞响应[27]，是理想的诊断结核分枝杆菌感染的靶抗原。
Brock等人比较了PPD、ESAT6和CFP10在体外刺激结核病人和卡介苗接种者外周血释放特异性IFN-γ的能力，发现虽然PPD刺激的IFN-γ水平比ESAT6和CFP10略高，但是它在结核病人和卡介苗接种者中都能刺激出水平相当的IFN-γ，而ESAT6和CFP10在结核病人中刺激的IFN-γ水平要远高于卡介苗接种者，但ESAT6和CFP10单独刺激IFN-γ的能力是相当的[28],[29]。大量的研究发现，这两种抗原组合在一起作为刺激抗原比它们单独使用可以使IGRA的敏感性提高至少10%，而不会降低检测的特异性[30]。
由于T细胞对抗原的识别存在MHC限制，记忆性的结核杆菌特异性CD4或CD8细胞一般不能直接被ESAT6或CFP10抗原激活，必须经过抗原的呈递过程，因而在IGRA技术中广泛使用的刺激抗原为来源于ESAT6和CFP6的合成肽的混合物，它们相互重叠10-15个氨基酸，分别覆盖整个ESAT6和CFP10抗原，能被更广泛的HLA分子递呈。
在2001年，美国FDA提出了QFT(Quanti FERON-TB)法作为第一代诊断结核感染的IGRAs[31-32]。此方法是采用PPD作刺激源,用ELISA检测血液中IFN-γ的含量从而对结核感染作出诊断。
为了提高检测灵敏度及可靠性，在2005年和2007年，美国FDA相继批准使用了第二代IGRAs Quanti FERON-TBGold test(QFT-G) (Cellestis Limited,Carnegie,Victoria,Aus-tralia)和第三代来确诊结核杆菌是否感染断结核杆菌感染[33-35]。
在2008年,美国FDA已经将T-SPOT作为第四种IGRA试剂批准使用[35]。其方法是分离出PBMC,用ESAT-6和CFP-10作为刺激抗原,以ELISPOT方法测定分泌γ-干扰素的T淋巴细胞的数量,从而诊断结核感染。ELISPOT技术是目前检测抗原特异性T细胞最敏感的方法之一,可以检测出1/100 000～ 1/50 000 PBMC中特异性抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞,经过酶联显色形成斑点,通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数从而计算抗原特异性细胞的频率。
2017年5月，由维瑅瑷基于自有专利技术自主研发生产的第二代IGRA试剂盒产品(A.TB2)正式获国家食品药品监督管理局批准。基于酶联免疫法即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。
三、IGRA的临床意义
目前，IGRA技术在诊断结核中的重要作用正在全世界的不同临床实践中不断证实和完善。
1、IGRA在LTBI诊断中的应用
由于结核分枝杆菌主要通过空气中的雾滴传播，因而感染的风险主要决定于与传染源接触的频率、时间长短和距离[36]。如果新的诊断方法比PPD试验具有更高的特异性和敏感性，那么它应该与暴露的水平更相关，而不受卡介苗接种的影响。
研究发现，无论是基于ELISPOT还是ELISA，IGRA与结核暴露的相关性与PPD试验相当甚至更好，但IGRA不受卡介苗的影响。在一项包括535名学生的大规模学校爆发性流行的调查中，按照离传染源的远近和暴露时间，基于ELISPOT的IGRA比TST明显更具相关性[37]。其他在低流行、中度流行和高流行场合进行的研究也得出了类似的结论。
基于ELISA的IGRA的研究结果也得出了类似的结论。最近进行的一项研究发现，随着暴露于结核杆菌的梯度逐渐增加，ELISA阳性的比例也随之增加[38]。
2、免疫抑制人群中潜伏性感染的诊断
准确地诊断和治疗细胞免疫功能受损的高危人群中的潜伏性结核，是临床医生普遍关注的问题。潜伏性结核进行性发展为活动性结核的高危人群主要包括艾滋病毒（HIV）感染者和免疫介导的炎性疾病如风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病和银屑病关节炎等疾病的患者[39，40]。由于免疫功能受损，PPD试验在这类人群中的敏感性很低。现有的研究发现，IGRA技术在这类人群中具有重要的临床意义。
3、HIV感染人群
ELISPOT/IGRA和ELISA/IGRA最近几年在HIV感染人群的结核诊断中进行了广泛评估。总体上，在HIV血清阳性人群中，ELISPOT/IGRA的敏感性要高于PPD试验，而ELISA/IGRA的敏感性虽然在多数情况下高于PPD试验，但是变化较大。
在结核低流行国家进行的研究比较了ELISPOT/IGRA、ELISA/IGRA和PPD试验在HIV感染者中的敏感性，发现与ELISA/IGRA相比，ELISPOT/IGRA比PPD试验更敏感，而且与先前的活动性结核病密切相关[41]。并且不同研究也证实ELISPOT/IGRA在HIV感染者中的表现令人满意，而且不受CD4细胞计数的影响[42]。严重的免疫抑制状态会增加不确定的ELISA/IGRA结果的比例，这会影响ELISA/IGRA在HIV阳性人群中对潜伏性结核的诊断结果[43-46]。
4、抗TNF-α治疗前结核杆菌感染的筛查
阻断TNF-α的分泌是治疗风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病和银屑病关节炎等免疫介导的炎性疾病的有效手段[47]。然而，由于TNF-α是宿主保护性防御结核杆菌的关键细胞因子，它和依赖于TNF的趋化因子在形成和维持限制结核菌的肉芽肿的过程中发挥着重要作用[48]。研究表明，患有这类疾病的潜伏性结核感染者在实施抗TNF-α治疗后变为活动性结核病的风险会增加4-5倍，98%的活动性结核病例是在抗TNF-α治疗后6个月内发生的，而且肺外结核的发生率也较高[48]。因而，在实施抗TNF-α前对这类病人进行结核菌感染的筛查，具有十分重要的意义[49]。
由于处于免疫抑制状态，PPD试验在这类病人中的假阴性比例较高。研究发现，在患有风湿性关节炎的病人中，PPD试验阴性的比例要显著高于免疫功能正常的健康人群 [50]。目前IGRA在这类病人中的研究数据还比较有限，而且在设计上主要是横断面研究。
总体来说，在接受免疫抑制治疗的自身免疫性疾病患者中，IGRA的敏感性要高于PPD试验。
5、活动性结核与潜伏性结核的鉴别
鉴别活动性结核和潜伏性结核是临床医生经常碰到的难题，特别是对痰培养或痰涂片阴性的疑似病人。现有的研究表明，联合PPD试验，基于全血的ELISA/IGRA和基于外周血单核细胞的ELISPOT/IGRA能区分潜伏性结核和活动性结核[51-53]。IGRA有可能发展成为一种诊断活动性结核的新工具。
四、IGRA检出结果解读[54]
1、阳性结果
1.1对既往有结核病史（治疗或未经治疗）或明确的结核病证据者（钙化淋巴结、肺内典型的钙化或陈旧结核病灶），无结核病中毒症状，但 IGRAs 阳性，表明机体曾经患过结核病，不能代表目前为活动性结核病，亦不能根据阳性检测值的高低判断结核病的转归。
1.2临床有典型的结核病中毒症状，影像学等检查结果支持结核病的诊断且临床排除了其他疾病者，IGRA阳性支持活动性结核病的诊断。
1.3临床有典型结核病中毒症状，但以目前临床检查手段未发现结核病患病证据，且临床排除了其他疾病者，IGRA阳性支持MTB感染状态的诊断，建议试验性抗结核治疗，既作为治疗手段，也是诊断方法之一。治疗过程中需要严密观察疗效（临床症状），再作出最终诊断，但 IGRA检测不能作为其疗效判断的指标。
1.4临床无结核病中毒症状及其他结核病患病证据者，IGRA阳性时，临床诊断为LTBI。
1.5 NTM感染：由于IGRA检测方法所用的抗原亦存在于堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和胃分枝杆菌中，因此当感染这几种NTM时，IGRA亦为阳性，临床上需要进一步鉴别诊断，区别 MTB 感染或这5种NTM感染。
第 1 和第 4 种情况时提示体内均有处于持留状态MTB ，前者为结核发病后机体处于痊愈状态，后者为MTB感染但未发病，两种情况均为稳定状态，需要随访观察，对结核病发病高风险人群，根据具体情况可以进行预防性化疗。第2和第3种情况代表体内感染了MTB 且呈活动状态，需要积极治疗。
2.阴性结果
IGRA所用抗原为 MTB 特异性抗原，阴性检测结果代表目前机体没有MTB特异抗原致敏的T淋巴细胞，即受检者目前未感染MTB。基于文献资料提示的 IGRA良好的敏感性和特异性，在得到 IGRA阴性结果时，临床诊断上首选排除结核病的诊断，尤其是在结核病高发地区、免疫功能正常人群及无可靠依据诊断结核病时，在可能的诊断排序上，结核病应列在其他疾病之后。
3.IGRA的假阳性或假阴性结果
IGRA方法作为结核病体外诊断方法，尽管在技术原理上尽可能避免了卡介苗接种和NTM感染对其检测结果的影响，但仍不能完全排除假阳性及假阴性的可能。
根据文献报道，临床应用过程中如下情况可能导致IGRA出现假阳性结果：妊娠、衣原体感染、克隆病、老年痴呆及操作过程中内毒素污染，可增加干扰素的分泌，出现假阳性结果。根据文献报道，下列情况可能会出现假阴性结果：服用三环类抗抑郁症药物、非甾体类抗炎药物、T细胞活化抑制剂或NTM感染、过敏状态、糖尿病、严重细菌感染、烧伤及应用糖皮质激素导致的粒细胞升高，IGRA可呈现假阴性。
五、第三代结核IGRA技术的技术路线
已上市的结核IGRA方法产品通过IFN-γ单因子对受试者是否是结核分枝杆菌感染者进行判别。如果基于IGRAs方法，进一步探索活动性结核病患者与潜伏性结核杆菌感染者全血经结核特异性T细胞抗原刺激后存在的多细胞因子差异，从而将二者区分，可进一步完善结核IGRAs产品，开发第三代能精准区分活动性结核病患者的诊断产品。
目前寻找用于区分潜伏性结核感染和活动性结核病的相关标志性细胞因子成为国内外研究的热点，文献报道的有可能用于活动性结核病诊断的细胞因子主要包括 IL-2， IL-10，IL- 15，IL-17，TNF-α，IP-10，MCP-1 以及EGF 等。
通过结核分枝杆菌特异性T细胞抗原体外刺激受试者全血，首先通过IFN-γ的检测筛选出阳性结果样本，确定为潜伏性结核感染患者或活动性结核病患者；同时或再次进行多细胞因子检测，得到可进一步区分潜伏性结核感染患者和活动性结核病患者的检测结果。
六、维瑅瑷的专利技术优势
IGRAs是基于特异性细胞因子检测来反应病原体特异性细胞免疫应答的一种基础技术。目前仅在结核菌感染诊断中得到应用与产业化，全球基于IGRAs的产业化开发仍处于早期阶段，未来将有极大的升值空间。
在IGRAs技术的推广中，既往的障碍在于T细胞抗原的生产成本与技术，维瑅瑷的专利技术（美国专利号7754219，中国专利号ZL02810886.8）是一种可快速产业化、规模化、易质控的T细胞抗原开发平台，可以将不同病原体的抗原位点快速转化、制作T细胞抗原，结合成熟的细胞因子检测，快速开发基于特异性细胞因子检测来反应病原体细胞免疫应答的诊断试剂产品。
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